Tema
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ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR PARA LA
GENOTIPIFICACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (VPH) EN PACIENTES ATENDIDAS
EN CONSULTA EXTERNA DEL HOSPITAL BERTHA CALDERÓN ROQUE, NOVIEMBRE
2015-FEBRERO 2016.
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Objetivo
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Detectar temprana los genotipos de alto riesgo
16, 18 o 33 proporcionando resultados que permitan un tratamiento temprano y
evaluación oportuna a las pacientes con Cáncer Cervicouterino asociado al
Virus del Papiloma Humano.
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Muestra
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Células cervicales obtenidas por “escobillado”
del cuello uterino de 27 pacientes con Lesión Escamosa Intraepitelial de Bajo
Grado (LEIBG), 23 pacientes con Lesión Escamosa Intraepitelial de Alto Grado
(LEIAG) y 12 muestras utilizadas como control negativo interno. Utilizando PBS 0.05% como medio de transporte.
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Tipos de ADN
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ADN viral de VPH 16, 18 y 33.
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Genes a amplificar con el tamaño en pares de bases
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140 pb para el HPV 16, 140pb para HPV 18 y 141pb
para HPV 33.
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Extracción DEL ADN
Lisis:
Separación:
Purificación:
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Se estandarizó a partir del kit comercial QUIAGEN- QIAamp DNA mini kit.
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Descartar el sobrenadante dejando 2ml del sedimento
y homogenizar en vortex, agregar 20µl de Proteasa QIAGEN o proteinasa K,
200ul de muestra y 200µl de buffer AL (buffer de lisis).
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Agregar 400ul de Etanol (96-100%) a la muestra y
mezclar nuevamente en Vortex. Centrifugar brevemente para remover las gotas
del interior de la tapa.
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Centrifugar a 6000xg (8000 rpm) por 1 minuto.
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Tipo de PCR
Desnaturalización:
Hibridación:
Elongación:
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PCR punto
final estandarizada
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95° por 1min (45 ciclos)
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56° primer 16 y 18-57° primer 33 por 1 min.
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72° por 1min
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Visualización por
electroforesis
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Electroforesis en gel de agarosa al 1.5-2.0%, con
buffer TBE 1X. Tiempo/ Voltaje: 1 hora 20 minutos a 120 voltios.
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Sensibilidad y especificidad
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Se realizó una PCR punto final estandarizada con: 100% de sensibilidad y 100% de
especificidad, reproducibilidad y repetibilidad de 100% y una eficacia
diagnóstica del 100%.
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Bibliografía:
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